參考清華大學盧元教授的文章

《無細胞體系非天然蛋白質合成研究進展》

為什么用cell-free系統（CFUPS）

非天然氨基酸表達難點：

（1）目標蛋白合成途徑非細胞內主反應，導致產物產量較低，純化步驟繁瑣；

（2）某些UNAAs不易穿過細胞膜屏障進入細胞，從而降低了細胞對UNAAs的利用率，限制UNAAs嵌入效率；

（3）非天然氨基酸的細胞毒性；

這些導致體內UNAAs的嵌入效率較低，特別是在多位點UNAAs嵌入時尤為明顯。

無細胞蛋白合成系統（Cell-free protein synthesis, CFS）是一種在沒有活細胞的情況下，利用細胞提取物進行蛋白質合成的技術。這種技術允許科學家在體外環境中合成蛋白質，而無需依賴細胞的內部機制。隨著技術的發展，無細胞非天然蛋白質合成系統（CFUPS）進一步擴展了這一概念，允許合成含有非天然氨基酸（UNAAs）的蛋白質。

在CFUPS中，使用外源DNA或mRNA作為模板，這些模板編碼的蛋白質序列包含非天然氨基酸。然后，將底物、能量物質、輔因子和非天然組分添加到反應體系中。這些非天然組分包括正交氨酰tRNA合成酶/正交tRNA（o-aaRS/o-tRNA）對，它們是專門設計的酶和tRNA，能夠識別并結合非天然氨基酸。在細胞提取物提供的多種酶的作用下，這些非天然氨基酸被整合到蛋白質鏈中，從而合成出含有非天然氨基酸的蛋白質。

CFUPS與細胞非天然蛋白質合成相比具有諸多的優點

2. 怎么做：無細胞體系UNAAs嵌入的方法

    在無細胞非天然蛋白質合成系統（CFUPS）中，嵌入非天然氨基酸（UNAAs）的方法是實現非天然蛋白質合成的關鍵。以下是一些主要的嵌入方法，它們在CFUPS中被廣泛使用：

（1）全局抑制：這種方法通過使用突變的釋放因子（release factors）或tRNAs來抑制正常的終止密碼子，使得翻譯過程在遇到終止密碼子時不會停止，而是繼續添加非天然氨基酸。

（2）終止密碼子抑制：這種方法利用特定的突變釋放因子，它們能夠識別終止密碼子，但不會終止翻譯過程，而是允許非天然氨基酸的插入。

（3）移碼抑制：這種方法通過改變mRNA的讀取框架來實現非天然氨基酸的嵌入。通過特定的策略，如使用特定的tRNAs或突變的tRNAs，可以在特定的位置插入非天然氨基酸，而不影響蛋白質的其余部分。

（4）有義密碼子再分配：這種方法涉及將一個原本編碼天然氨基酸的密碼子重新分配給非天然氨基酸。這通常通過使用突變的tRNAs來實現，這些tRNAs能夠識別特定的有義密碼子，并將非天然氨基酸添加到蛋白質鏈中。

（5）非天然堿基對：這種方法通過擴展遺傳密碼來實現非天然氨基酸的嵌入。通過引入新的堿基對，可以編碼更多的氨基酸，包括非天然氨基酸。這通常涉及到使用經過工程改造的聚合酶和tRNAs。

    這些方法的發展和應用，使得科學家能夠在蛋白質合成過程中精確地控制非天然氨基酸的位置，從而為蛋白質工程和藥物設計提供了新的工具。

3. 非天然氨基酸蛋白有什么用？

無細胞蛋白合成系統（CFUPS）在合成具有特定功能的非天然蛋白質方面取得了顯著進展，并在多個領域展現出其重要性和應用潛力。以下是一些主要的應用領域：

（1）蛋白藥物合成：CFUPS可以用于合成具有治療潛力的蛋白質藥物，包括抗體、酶和激素等。通過在蛋白質中嵌入非天然氨基酸，可以提高藥物的穩定性、延長半衰期或增強其生物活性。

（2）病毒樣顆粒（Virus-like particles, VLPs）：VLPs是模仿病毒結構的納米級顆粒，但不含病毒遺傳物質，因此不具有傳染性。CFUPS可以用于合成VLPs，這些顆粒在疫苗開發和藥物遞送系統中具有應用潛力。

（3）膜蛋白合成：膜蛋白在細胞信號傳導、物質轉運和能量轉換等過程中發揮關鍵作用。CFUPS可以用于合成具有特定功能的膜蛋白，這有助于研究其結構和功能，以及開發針對這些蛋白的藥物。

（4）蛋白質材料：CFUPS可以用于合成具有特定物理或化學性質的蛋白質材料，這些材料可以用于組織工程、生物傳感器或納米技術等領域。

（5）蛋白質間相互作用研究：CFUPS提供了一種工具，用于研究蛋白質之間的相互作用，這對于理解細胞內信號傳導途徑和開發新的干預策略至關重要。

（6）開發新型蛋白材料：通過CFUPS合成的非天然蛋白質可以被設計成具有特定的結構和功能，用于開發新型的生物材料，這些材料可能具有的機械性能或生物相容性。

4. 后續開發方向

將來無細胞非天然蛋白質合成系統需要朝著4個方面發展，分別是：1)開發更有效的OTSs，提高非天然氨基酸的嵌入效率；2)實現在目標蛋白的多個位點嵌入多種UNAAs，擴大非天然蛋白質的種類；3)解決UNAAs多樣性帶來的生物不相容性，使非天然蛋白質的產量得到大幅度的上升；4)進一步降低非天然蛋白質合成的成本，使其能夠帶來可觀的經濟效益，促進工業化應用。最大限度去開發無細胞非天然蛋白質合成平臺的潛力，使其能夠更好地應用于科學基礎研究及工業生產研究。

挑戰（Challenges）

• UNAA嵌入位點的選擇：選擇合適的非天然氨基酸（UNAA）嵌入位點。

• 多位點UNAA嵌入：實現在蛋白質中多個位點嵌入UNAAs。

• 與內源元素的交叉反應：避免與細胞內源性成分的反應。

• UNAA嵌入效率低：提高UNAA嵌入的效率。

• 困難的核糖體工程：改進核糖體工程以適應非天然氨基酸的合成。

• 缺乏可擴展的系統：開發可大規模應用的CFUPS系統。

• 高成本：降低CFUPS系統的經濟成本。

• 耗費時間和勞動力：減少制備、純化和分析過程中的時間和勞動力消耗。

潛在改進（Potential improvements）

• 開發非天然蛋白質的蛋白質折疊預測算法：幫助預測UNAAs嵌入后蛋白質的折疊狀態。

• 開發無需純化的高通量篩選方法：簡化篩選過程，提高效率。

• 篩選更多正交翻譯對：增加可用于UNAA嵌入的正交氨酰tRNA合成酶/正交tRNA對。

• 加速開發移碼抑制、有義密碼子再分配和非天然堿基對方法：推動這些嵌入技術的發展。

• 進化正交翻譯對：通過進化生物學方法改進正交翻譯對的性能。

• 工程化底盤生物：通過基因工程改造底盤生物以適應CFUPS系統。

• 優化CFUPS系統的成分組成：調整反應體系以提高UNAA嵌入效率。

• 發展體外核糖體進化平臺：用于改進核糖體以適應非天然氨基酸的合成。

• 模仿標準生物反應器配置：在大規模生產中應用CFUPS系統。

• 簡化產品分析方法：減少分析過程中的復雜性。

• 自行合成試劑：包括UNAAs、tRNAs等，以降低成本。

• 優化能量供給系統：改進CFUPS系統中的能量供應。

• 優化細胞提取物、表達模板和OTS組分的制備：提高制備過程的效率和成本效益。

• 簡化制備過程：減少制備過程中的時間和勞動力消耗。

• 簡化純化和分析過程：提高純化和分析的效率。