三、體系構(gòu)建

將混合好的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至搖床中，溫度25℃、180rpm，反應(yīng)16h，確保蛋白表達(dá)。

次日一早，打開(kāi)搖床就看到了陽(yáng)性對(duì)照醒目的綠色熒光。既然陽(yáng)性對(duì)照表達(dá)了，目標(biāo)蛋白想來(lái)不成問(wèn)題！滿懷期待開(kāi)始離心、跑膠鑒定。

不愧是師兄力薦的“法寶"，沒(méi)有辜負(fù)我的厚望，第一次實(shí)驗(yàn)，我的蛋白就在上清中成功表達(dá)了！

1.無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)試劑盒可以用線性模板也可以用質(zhì)粒模板，線性模板更加方便快捷，但是質(zhì)粒模板表達(dá)量一般較高。

2.組分A、B在實(shí)驗(yàn)前要提前放在冰上融化，防止試劑失效。使用前先用移液槍吹打混勻，再吸取相應(yīng)體積。

3.微孔板四周可以加入適量雙蒸水，防止孵育過(guò)程中體系水分蒸發(fā)。本次實(shí)驗(yàn)因?yàn)橐^(guò)夜表達(dá)，為了確保反應(yīng)體系不被蒸干，我在96孔板最外側(cè)一周的所有孔位里都加了水，而且在搖床四角也各放置了一只裝水的離心管。

4.對(duì)于復(fù)雜蛋白表達(dá)，可以延長(zhǎng)孵育時(shí)間，保證蛋白充分表達(dá)。

5.如果調(diào)整反應(yīng)體積，需要按照說(shuō)明書(shū)推薦隨之調(diào)整反應(yīng)容器。

初次表達(dá)包涵體大獲成功，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)究竟是“何方神圣"？在實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后，我粗略了解了一下這一新技術(shù)，發(fā)現(xiàn)它的強(qiáng)大不止于此。

無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)（Cell-free protein expression，CFPS）是指將細(xì)胞內(nèi)合成蛋白所需要的RNA聚合酶、核糖體及轉(zhuǎn)錄翻譯輔助因子等分子機(jī)器提取出來(lái)，并輔以核苷酸、氨基酸、能量物質(zhì)及基因模板，在沒(méi)有活細(xì)胞參與的體外直接合成蛋白質(zhì)的生物合成反應(yīng)。

受細(xì)胞自身生理功能限制，有些蛋白在傳統(tǒng)的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)量低甚至不能表達(dá)，而無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)可以擺脫這種限制，廣泛適用于細(xì)胞因子、抗體、膜蛋白、毒性蛋白、包涵體蛋白表達(dá)等場(chǎng)景。此外，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)反應(yīng)周期短、易與自動(dòng)化設(shè)備結(jié)合、自由度與可控程度高，適合蛋白快速交付、酶定向進(jìn)化篩選、AI蛋白制造、ADC藥物開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域，可謂是蛋白表達(dá)領(lǐng)域的“新勢(shì)力"。

隨著合成生物學(xué)發(fā)展，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)已然嶄露頭角，大有騰飛之勢(shì)。技術(shù)的發(fā)展是推動(dòng)科學(xué)研究進(jìn)步的重要助力，善于利用新技術(shù)，有時(shí)能使科研過(guò)程事半功倍，我也算是深有體會(huì)了！