跨膜蛋白目前仍然是結(jié)構(gòu)生物學中具挑戰(zhàn)性的靶點之一。它們參與多種生物過程，包括光合作用、呼吸、信號轉(zhuǎn)導、分子轉(zhuǎn)運和催化等。有文章報道，跨膜蛋白占大多數(shù)生物體蛋白質(zhì)組的 20% 至 30%，占藥物靶標的 40% 以上。此外，全長跨膜蛋白的研究尤為重要，因為只有完整的三維結(jié)構(gòu)才能真實反映其生物學功能與藥物結(jié)合特性。

G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)、離子通道和轉(zhuǎn)運蛋白等跨膜蛋白家族的異常與癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病等重大人類疾病密切相關(guān)。這些疾病機制研究和藥物開發(fā)都依賴于對全長跨膜蛋白結(jié)構(gòu)的精確解析。例如，大量研究表明5-HT1A 受體（GPCRs超家族成員）與正常焦慮樣行為的發(fā)展有關(guān)，該受體是抗抑郁藥（如丁螺-環(huán)酮）和抗焦慮藥的重要作用靶點。

圖1:（A）α-螺旋和β-桶跨膜蛋白的結(jié)構(gòu)；（B）跨膜蛋白示意圖：G 蛋白偶聯(lián)受體 （GPCR）、離子通道、轉(zhuǎn)運蛋白、受體。

圖2：表達條帶

盡管跨膜蛋白研究意義重大，但其表達與純化一直是結(jié)構(gòu)生物學和藥物開發(fā)領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)細胞表達系統(tǒng)面臨幾個關(guān)鍵瓶頸：

1.低表達水平：膜蛋白的天然豐度通常太低，無法分離出足夠量的物質(zhì)用于功能和結(jié)構(gòu)研究。在傳統(tǒng)的細胞表達系統(tǒng)（如大腸桿菌、酵母或哺乳動物細胞）中，大量表達跨膜蛋白通常是非常困難的。

許多跨膜蛋白的高表達會對宿主細胞產(chǎn)生毒性，且其合成和插入膜的過程復雜，導致表達量極低，難以滿足結(jié)構(gòu)研究（如結(jié)晶）所需的大量純化蛋白。

2.溶解性與穩(wěn)定性問題：跨膜蛋白需要在脂質(zhì)雙分子層中正確折疊，其疏水跨膜區(qū)在細胞質(zhì)中易形成聚集體，導致錯誤折疊和非功能性蛋白。

3.難以穩(wěn)定形式純化蛋白質(zhì)：表達量低和穩(wěn)定性問題直接導致了純化的困難。需要引入親和標簽（如His-tag）并進行多步純化，整個過程不僅得率低，而且蛋白容易在純化過程中降解。天然膜環(huán)境是通過其脂質(zhì)組成和理化性質(zhì)賦予膜蛋白相當大的穩(wěn)定性。當溶解在去垢劑中時，許多膜蛋白會迅速變性并經(jīng)常聚集從而無法純化。

無細胞蛋白表達技術(shù)為克服上述瓶頸提供了創(chuàng)新性解決方案：

1.模擬跨膜環(huán)境：無細胞系統(tǒng)允許直接添加脂質(zhì)體、納米圓盤或去污劑等膜模擬環(huán)境，使跨膜蛋白在合成的同時就能進入類膜結(jié)構(gòu)，極大提高了正確折疊率。

2.毒性蛋白的高效表達：由于無細胞系統(tǒng)不受細胞生長限制，可以高效表達對細胞有毒性的跨膜蛋白。

3.靈活調(diào)控氧化還原環(huán)境：跨膜蛋白二硫鍵的形成對其穩(wěn)定性至關(guān)重要。無細胞系統(tǒng)可精確調(diào)控氧化還原電位，促進二硫鍵的正確形成，而無需復雜的細胞工程改造。

4.快速篩選表達條件：無細胞系統(tǒng)可實現(xiàn)高通量條件優(yōu)化，快速篩選適合特定跨膜蛋白表達的脂質(zhì)/去污劑組合、分子伴侶和緩沖條件，大幅縮短優(yōu)化周期。

5.同位素標記簡化：對于NMR研究，無細胞系統(tǒng)可輕松實現(xiàn)特異性氨基酸標記，解決了全長跨膜蛋白同位素標記的難題。

圖3:體內(nèi)和體外生產(chǎn)重組膜蛋白的一般策略

圖4:人 STING1 全長蛋白表達條帶

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