細胞膜是細胞與外界環境的分界線，而膜蛋白（MPs）作為細胞的基本組成成分，介導許多關鍵過程，如信號轉導、成分傳輸、酶反應、細胞之間的通信等。在生命科學領域，研究膜蛋白對于理解細胞功能、疾病機制及藥物開發具有重要意義。膜蛋白的表達與純化一直是研究中的難點，其復雜的結構、疏水性、低表達量、易形成包涵體以及潛在的毒性使得傳統表達方法面臨諸多挑戰。而無細胞蛋白表達技術（ CFPS）的興起，為膜蛋白研究帶來了革命性的變革。

膜蛋白作為一類特殊的蛋白質，其表達與純化過程尤為復雜。除了常見的問題外（比如：膜蛋白定位、跨膜蛋白疏水性、蛋白毒性、表達水平低等），還有以下一些挑戰：

稀有密碼子：部分膜蛋白基因含有稀有密碼子，這些密碼子不能被宿主細胞識別，導致多肽鏈合成不完-全，從而不能形成功能性膜蛋白。

易形成多聚體：膜蛋白在熱變性過程中容易形成多聚體，導致抗體無法識別或條帶分子量發生變化或扭曲，從而影響實驗結果。

提取方法復雜：由于膜蛋白與膜結合緊密，不易從膜上洗滌下來，特別是跨膜蛋白，具有多重跨膜結構域，提取分離困難。目前常用的提取方法包括超速離心、密度梯度離心等，但每種方法都有其局限性。

檢測難度大：膜蛋白在樣品中的表達量通常不高，在總蛋白中占比較低，用總蛋白檢測時，目標蛋白含量可能低于檢測下限，無法檢測到。此外，膜蛋白的western Blot實驗也面臨諸多挑戰，如條帶不清晰、分子量不對或條帶扭曲等。

對于體外結構研究來說（如X射線衍射、核磁共振光譜或交聯方法等）CFPS已經成為一個日益重要的研究領域，并且它在其他領域也有很高的潛力，包括工業蛋白質生產等。一般來說，CFPS可以在不使用完整活細胞的情況下進行體外蛋白的合成，只需要合成系統中包含核糖體和氨基酰tRNA合成酶等核心蛋白質表達機制的細胞提取物，同時提供能量恢復系統、氨基酸、NTP、tRNA和DNA等必需的前體即可。與重組蛋白生產相比，它有以下幾個主要優勢：

• CFPS可以表達對細胞有損害的蛋白質或肽，包括膜整合蛋白、疫苗等；

• CFPS系統允許通過不同的策略有效地納入非天然氨基酸（NSAA）；

• CFPS的蛋白純化過程可簡化為一兩個親和力純化步驟，表達后的提取物也可以直接應用于下游工作；

• CFPS過程中免去了許多耗時和關鍵的步驟（比如細胞培養）；

• CFPS允許在開放系統中直接解決降解、錯誤靶向或不溶性表達等問題，允許獨立于細胞活力或生長的情況下優化蛋白質生產。

圖1:無細胞蛋白表達技術合成膜蛋白的實驗方案

CFPS系統是膜蛋白合成的一種新的核心平臺。其在人工疏水環境中的表達允許膜蛋白的共翻譯溶解和折疊，如納米膜或膠束。在沒有疏水化合物的情況下，合成的膜蛋白可定量沉淀，同時仍然可以保留很大一部分折疊的結構元素。即使是復雜的膜蛋白（比如大型轉運體），也可以在幾個小時內合成大量此類沉淀物。沉淀物可以在洗滌劑中溶解或重組成膜，以進行后續的結構或功能分析。

我們知道，G蛋白偶聯受體（GPCR）在細胞-細胞信號傳導過程中發揮著核心作用，是人類基因組中最大的膜蛋白群體，大約35%的商業藥物是針對這些蛋白質。對G蛋白偶聯受體進行結構研究的先決條件是制備以毫克蛋白質為單位的高度濃縮、穩定且具有生物活性的樣本。傳統的表達方法會存在很多問題，而CFPS可以規避這些問題。基于其開放性，允許研究人員向系統中添加物質。這促進了蛋白表達和溶解，允許快速篩選出最佳表達條件。

此外，膜基納米顆粒（如脂質體、聚合物和脂質納米顆粒）的表面改性，以及靶向分子（如結合蛋白）的修飾是治療材料設計的重要一步。然而，這種修飾可能既昂貴又耗時，需要細胞宿主進行蛋白質表達，將會花費漫長的純化和共軛時間來將蛋白質附著在納米載體表面，這最終限制了有效蛋白質共軛納米載體的發展。目前，已有研究使用CFPS系統來快速創建蛋白質共軛膜基納米載體。使用這種方法，多種類型的功能結合蛋白，包括affibodies、scFvs等，都可以通過無細胞表達，并在一個鍋中結合到脂質體上。此外，可以進一步擴展到其他納米顆粒，包括聚合物和脂質納米顆粒，適用于多種共軛策略，包括表面附著以及集成到納米顆粒膜中。利用這些方法，證明了雙特異性人工抗原呈遞細胞的快速設計，并增強了脂質納米顆粒貨物的體外輸送。預計這種工作流程將能夠快速生成基于膜的輸送系統，并增強我們創建細胞模仿療法的能力。

圖3：膜基納米顆粒的快速合成

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